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液相色譜柱

液相色譜柱是高效液相色譜（HPLC）系統(tǒng)的核心部件，其性能直接影響到被測物質(zhì)的分離效果和測定準(zhǔn)確性。因此，正確安裝、活化、使用和維護色譜柱對于確保檢測結(jié)果的可靠性至關(guān)重要。本文將為您提供全面的色譜柱使用與維護建議。
1.使用前的檢查和須知事項
(1) 檢查包裝盒是否完整，盒子側(cè)面有產(chǎn)品信息與自己購買的是否一致。
(2) 打開包裝檢查色譜柱表面有無傷痕，柱兩端是否有塑料堵頭完全封住。
(3) 查看盒內(nèi)是否有檢查報告及簽名，檢查報告中有詳細(xì)記錄，填料批號、貨號、序列號及柱性能等參數(shù)。
2.色譜柱的安裝
液相色譜柱通常會在柱身上標(biāo)明方向，安裝新色譜柱時，應(yīng)確保連接管路與色譜柱所標(biāo)明的方向一致，避免反沖。另外，連接管路盡量使用合適的細(xì)徑管線，柱的兩端連接端口務(wù)必平整。若接口不匹配，可能會導(dǎo)致柱效下降、峰形拖尾或滲漏等問題。

一、反相色譜柱（包括C18、C8、苯基）
使用方法：
1. 色譜柱出廠時都有存儲液，使用時需用互溶試劑替換。
2. 使用前用潔凈的水與乙腈沖洗系統(tǒng)，確保系統(tǒng)干凈，不含任何緩沖鹽和污染物。
3. 將新色譜柱入口端接上系統(tǒng)，出口端先不要連接，在低流速條件下0.2mL/min用純乙腈潤洗色譜柱（色譜柱時間長的話柱頭兩端儲存液容易干），然后2分鐘后流速升高到0.5，當(dāng)溶劑均勻從柱口端流出，停泵，再將出口端連接到系統(tǒng)檢測器上（這樣可以避免氣泡進入檢測系統(tǒng)，并且可以快速達到平衡）。備注：如果是色譜柱粒徑是3μm及以下的流速就減半，防止壓力過高。
4. 同樣先低流速開始0.2mL/min 逐步過渡到正常流速，待基線平穩(wěn)后（5-10倍柱體積）換成流動相平衡，帶基線平衡后開始進樣。
5. 當(dāng)流動相有緩沖鹽或離子對試劑時需要確保柱內(nèi)有充足的水，再此前用90:10（水：乙腈）充分過渡半小時以上，再換成流動相平衡，待到平衡好后再進樣。
保存方法：
● 不含緩沖鹽或離子對試劑項目：
使用流動相沖洗至基線平穩(wěn)，換成乙腈：水=2：8沖洗半小時（流速1mL/min），再換成乙腈保護30分鐘，最后色譜柱應(yīng)使用堵頭將兩端密封。
● 含緩沖鹽或離子對試劑項目：
使用流動相沖洗至基線平穩(wěn)，換成乙腈：水=1：9沖洗1小時（流速1mL/min），再換成乙腈保護30分鐘，最后色譜柱應(yīng)使用堵頭將兩端密封。注意，緩沖鹽容易析出，再使用前和結(jié)束后需要多用高比例水沖洗。
清洗再生方法：
色譜柱使用一段時間后容易出現(xiàn)各種問題：
1. 柱壓升高：一般是柱頭篩板污染（固體顆粒或強保留物），可以用溶解污染物的溶劑長時間的反向沖洗（低流速0.5mL/min）2小時以上，或者使用保護柱套；
2. 緩沖鹽正確使用：緩沖鹽溶于水卻很難溶于有機試劑，使用后應(yīng)該高比例水沖洗色譜柱；
3. 強保留物滯留色譜柱：其在色譜柱中一段時間積累后會產(chǎn)生額外的保留行為，引起峰變寬，拖尾柱效下降等，同時柱壓也會不斷升高而使色譜柱損壞。建議用50℃左右甲醇：水=1：3（流速1mL/min）沖洗1小時之后換成 3：1 再沖洗1小時。
注意事項：
進行實際樣品分析的推薦步驟：
1. 確保流動相潔凈，每隔24-48小時就應(yīng)配置流動相，并經(jīng)常清洗流動相溶劑瓶，以免流動相長菌，確保實驗室水系統(tǒng)工作正常；
2. 確保樣品不含顆粒雜質(zhì)，如樣品過臟或有微粒存在就不能直接進樣，避免影響色譜柱壽命。一般需要先用濾膜過濾樣品，建議用0.22μm濾膜；
3. 確保樣品與流動相條件相兼容，進樣后不會發(fā)生沉淀，通常使用流動相或比流動相洗脫強度弱的溶液（有機比列較低的）溶解或稀釋樣品；
4. 常規(guī)分析過程中，每針間隔若干針清洗柱內(nèi)可能累積的污染物，完成分析后徹底清洗色譜柱，除去緩沖鹽和污染物。

二、氨基柱和硅膠柱
使用方法：
●正相條件下使用：
1. 確保系統(tǒng)內(nèi)不含緩沖鹽，如果有則需要先除去管路中的緩沖鹽；
2. 取下色譜柱，用二通管代替色譜柱連接好管路；
3. 用甲醇或乙腈以2.0mL/min沖洗15min，除去管路中的水；
4. 用異丙醇以2.0mL/min流速沖洗15min，除去管路中的甲醇或乙腈；
5. 取下二通管，換上色譜柱，用異丙醇以0.5mL/min沖洗色譜柱45min；
6. 換上純正己烷作流動相過渡，以1.0mL/min沖洗色譜柱15min；（因為異丙醇的極性很強，哪怕是少量的異丙醇進入到流動相中都可能引起保留時間的顯著變化）；
7. 換上分析流動相走基線，通常這個過程至少需要30min，基線平穩(wěn)后進樣。
● 正相體系換成反相體系的方法：
1. 取下正相色譜柱，用二通管代替色譜柱連接管路，用異丙醇以2.0mL/min沖洗15min；
2. 換上純甲醇或乙腈，以2.0mL/min的流速沖洗10min。
●反相條件下使用：
氨基柱和硅膠柱出廠時通常保存在正己烷：異丙醇體系中，使用前先用異丙醇（0.2mL/min）過渡1晚，再用乙腈以0.5mL/min的流速沖洗3小時，后換成流動相沖洗1小時后待基線平衡后開始做樣。使用氨基柱時需要注意，由于氨基柱需要過渡飽和，一般前面幾針效果不一定能達到要求，所以多進幾針飽和后就正常了。
保存方法：
●正相使用
1. 因為出廠時氨基柱和硅膠柱通常保存在正己烷：異丙醇體系中，所以正相條件下使用時可以直接用流動相跑基線。
2. 由于基質(zhì)具有較強的吸附性能，為防止強保留物質(zhì)在色譜柱中的存留，每天分析任務(wù)完成后，需用異丙醇以0.5mL/min流速沖洗色譜柱60min，最后保存在異丙醇中；
3. 長時間保存最好用異丙醇沖洗色譜柱后，用正己烷封存，然后擰緊兩端的塑料篩頭。
●反相使用
保存方法和反相柱相近，用乙腈沖洗1小時，如有緩沖鹽用乙腈水和流動相比例接近沖洗1小時后換成乙腈沖洗40分鐘。如短期不用，乙腈保存；長期不用時需依次用甲醇、異丙醇置換，最后用正己烷保存。
清洗再生方法：
●正相使用
第一步：異丙醇（5 倍柱體積）
第二步：50%乙腈水溶液（5 倍柱體積）
第三步：含 0.1% EDTA 的水溶液（10 倍柱體積）
第四步：0.2M 醋酸銨水溶液（20 倍柱體積）
第五步：50%乙腈水溶液（5 倍柱體積）
第六步：乙腈（10 倍柱體積，封存）
●反相使用（參照C18柱方法）
1. 柱壓升高：一般是柱頭篩板污染（固體顆?；驈姳Ａ粑铮梢杂萌芙馕廴疚锏娜軇╅L時間的反向沖洗（低流速0.5mL/min）2小時以上，或者使用保護柱套。
2. 緩沖鹽正確使用：緩沖鹽溶于水卻很難溶于有機試劑，使用后應(yīng)該高比例水沖洗色譜柱。
3. 強保留物滯留色譜柱：其在色譜柱中一段時間積累后會產(chǎn)生額外的保留行為，引起峰變寬，拖尾柱效下降等，同時柱壓也會不斷升高而使色譜柱損壞。建議用50℃左右甲醇：水=1：3（流速1mL/min）沖洗1小時之后換成 3：1 再沖洗1小時。
注意事項：
1、氨基柱和硅膠柱可以用于正相條件，也可以用于反相條件，但需要注意正相溶劑和反相溶劑往往是不互溶的，對這一點的忽略可能會帶給使用者一些麻煩，對于新購買到的柱子，首先請注意打開分析測試說明書，了解柱子的保存溶劑。如果保存溶劑與將要使用的流動相極性不同不互溶就會造成色譜柱損壞，所以切換正反向流動相時請先用異丙醇過渡。過渡過程中注意因異丙醇粘度較大，會導(dǎo)致柱壓很高，適當(dāng)調(diào)低流速即可。如果要使用的流動相中還含有緩沖鹽類，建議在用分析流動相之前，先用不含緩沖鹽的同比例流動相過渡，這樣可避免緩沖鹽在分析柱內(nèi)的析出。
2、氨基柱和硅膠柱用于正相條件，使用時需注意如下事項：
⑴ 因為出廠時氨基柱保存在正己烷/異丙醇＝99.5/0.5中，所以正相條件下使用時可以直接用流動相跑基線；
⑵ 由于基質(zhì)具有較強的吸附性能，為防止強保留物質(zhì)在色譜柱中的存留，每天分析任務(wù)完成后，需用異丙醇以0.5mL/min流速沖洗色譜柱60min，最后保存在異丙醇中；
⑶ 長時間保存最好用異丙醇沖洗色譜柱后，用正己烷封存，然后擰緊兩端的塑料篩頭